Η PCR ΩΣ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ DNA ΑΛΟΓΟΥ ΣΤΟ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΚΡΕΑΣ

Γενετικό υλικό αλόγου σε δύο προϊόντα κρέατος στην Ελλάδα εντόπισε ο ΕΦΕΤ, στο πλαίσιο συνεχόμενων ελέγχων. Τα δυο θετικά δείγματα που εντοπίστηκαν αφορούν σε ισάριθμες παρτίδες βόειου κατεψυγμένου κρέατος συνολικής ποσότητας 1.064 κιλά με την επισήμανση FROZEN BEEF MEAT NECK και FROZEN BEEF MEAT TOPSIDE της επιχείρησης «ΖΗΚΟΥΔΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ». Ο Ενιαίος Φορέας Ελέγχου Τροφίμων έχει προχωρήσει σε συνολικά 76 δειγματοληψίες.
 Οι εν λόγω παρτίδες κρέατος είχαν εισαχθεί από τη Ρουμανία και όπως αναφέρει ο ΕΦΕΤ, έχουν ήδη δεσμευθεί από το Τμήμα Κτηνιατρικής της Διεύθυνσης Αγροτικής Οικονομίας και Κτηνιατρικής της Περιφερειακής Ενότητας Πειραιά στις 14.02.2013.Ενα ακόμη προϊόν με DNA αλόγου εντοπίστηκε από τον ΕΦΕΤ.Πρόκειται για το προϊόν «Καβουρμάς» με την εμπορική επωνυμία «Παραδοσιακά Αλλαντικά ΑΝΑΝΙΑΔΗ», το οποίο παρασκευάζεται και συσκευάζεται από την επιχείρηση «ΑΡΙΣΤΗ ΑΛΛΑΝΤΙΚΑ ΑΒΕΕ» με έδρα το Αιγάλεω, για λογαριασμό της επιχείρησης «ΑΝΑΝΙΑΔΗΣ ΑΒΕΕ» με έδρα την Καβάλα.Το εν λόγω προϊόν δεν είχε διακινηθεί και δεσμεύτηκε ολόκληρη η ποσότητα στις αποθήκες της εταιρείας «ΑΝΑΝΙΑΔΗΣ ΑΒΕΕ» στην Καβάλα ύστερα από άμεσες ενέργειες της Περιφερειακής Διεύθυνσης Ανατολικής Μακεδονίας και Θράκης του ΕΦΕΤ. 

Το νέο διατροφικό σκάνδαλο που έχει ξεσπάσει στην ελλάδα με την ανακάλυψη γενετικού υλικού αλόγου σε προιόντα κρέατος έχει ανησυχήσει τόσο τους καταναλωτές,όσο και τους ελεγκτικούς φορείς.Ας δούμε όμως ποιοί είναι εκείνοι οι τρόποι-εργαλεία που χρησιμοποιούνται από τον ΕΦΕΤ για την ταυτοποίηση  προιόντων κρέατος ,και στην προκειμένη περίπτωση του κρέατος αλόγου με μεθόδους DNA.

Η σημασία της νοθείας των τροφίμων, τόσο από την οπτική γωνία μιας ελεγκτικής

υπηρεσίας που προστατεύει την υγεία και τα δικαιώματα του καταναλωτή, όσο και

από αυτήν της βιομηχανίας, θεωρούμε ότι είναι προφανής. Ο διοικητικός έλεγχος

που διενεργεί ένα κλιμάκιο ελεγκτών στα διάφορα εμπορικά παραστατικά για την

καταπολέμησή της απαιτεί αρκετές φορές πολλές ανθρωποώρες εργασίας, χωρίς

ωστόσο να επιτυγχάνονται πάντα τα επιθυμητά αποτελέσματα. Αντιθέτως, μια

εργαστηριακή ανάλυση του «ύποπτου» προϊόντος μπορεί να οδηγήσει στο επιθυμητό

αποτέλεσμα πολύ πιο γρήγορα και με μικρότερο κόστος από αυτό ενός ενδελεχούς διοικητικού 

ελέγχου.

Η επιστημονική βιβλιογραφία έχει να επιδείξει  έναν μεγάλο αριθμό πρωτοκόλλων ανάλυσης για μια πληθώρα νοθειών  διαφόρων κατηγοριών  σε πολλά είδη τροφίμων, επεξεργασμένα και μη. Κατά συνέπεια, τα  αναλυτικά «εργαλεία» που είναι διαθέσιμα για την  ανίχνευση της νοθείας είναι  αρκετά και σε συνδυασμό με συγκεκριμένα μόρια ή ομάδα μορίων –στόχων

συνήθως καλύπτουν όλες τις περιπτώσεις. Ενδεικτικά, για την περίπτωση της

μερικής ή ολικής αντικατάστασης ενός είδους από ένα άλλο, αναφέρονται τα εξής:

α) Αναλογία ισοτόπων με φασματομετρία μάζας

β) Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού

 γ) Φασματοσκοπία υπερύθρου

 δ) ανοσοενζυμικές τεχνικές και

ε) τεχνικές διαχωρισμού (ηλεκτροφόριση, υγρή/αέρια χρωματογραφία)

 Ειδικότερα, για την ταυτοποίηση της ταξινομικής προέλευσης

των οργανισμών που απαρτίζουν ένα τρόφιμο, τα μόρια –στόχοι που αρχικά

χρησιμοποιήθηκαν είναι, μεταξύ άλλων, τα αμινοξέα, οι πολυφαινόλες, τα

καροτενοειδή και οι ανθοκυαννίνες, τα λιπαρά, οξέα, οι στερόλες, τα τριγλυκερίδια

καθώς και τα πρωτεϊνικά προφίλ.

Στις περισσότερες των περιπτώσεων όμως, και ειδικότερα στην διαφοροποίηση των ποικιλιών ενός φυτικού είδους, τα προφίλ μεταβολιτών επηρεάζονται άμεσα από διάφορους εξωγενείς παράγοντες, όπως η γεωγραφική προέλευση, οι περιβαλλοντικές συνθήκες, οι καλλιεργητικές πρακτικές κλπ. Κατά συνέπεια, η αποτελεσματική τους χρήση

απαιτεί τεράστια βάση  δεδομένων, ενώ πολλές φορές περιορίζεται σε τρόφιμα μιας ποικιλίας και όχι μίγματος ποικιλιών.

Στην περίπτωση των ζωικών τροφίμων οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται κατά την θερμική επεξεργασία ενώ η έκφρασή τους πολλές φορές  σχετίζεται με το είδος του  ζωικού ιστού

.

Κατά την ανάλυση όμως του  DNA οι  παραπάνω περιορισμοί δεν υφίστανται μιας και

αυτό  είναι πιο σταθερό στην επεξεργασία από ότι οι  πρωτεΐνες, ανιχνεύεται σε όλους τους ιστούς, δεν εξαρτάται από εξωγενείς παράγοντες όπως τα  προφίλ μεταβολιτών, ενώ η ανάλυσή του μπορεί να πραγματοποιηθεί από έναν  αρκετά ικανοποιητικό αριθμό συνδυασμών μεθόδων απομόνωσης, ενζυμικής επεξεργασίας, διαχωρισμού και ανίχνευσης.

PCR ΓΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ DNA

Οι περισσότερες -αν όχι όλες –DNA αναλυτικές προσεγγίσεις περιλαμβάνουν σε κάποιο στάδιο τον πολλαπλασιασμό του θραύσματος προς ανάλυση μέσω της

αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).

Η κατασκευή βιβλιοθηκών μας δίνει τη δυνατότητα να απομονώσουμε το βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο. Στη συνέχεια πολλαπλασιάζονται τα βακτήρια του κλώνου και δημιουργούνται πολλά αντίγραφα του γονιδίου που περιέχει. Η δημιουργία πολλών αντιγράφων είναι απαραίτητη προϋπόθεση  για τη μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου. Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR: Polymerase Chain Reaction) μας επιτρέπει να αντιγράψουμε επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές, ειδικές αλληλουχίες DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA(που προέρχεται από μια ποσότητα κρέατος ), χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου Η τεχνική αυτή που άρχισε να εφαρμόζεται ευρέως από το 1985, έχει αυξήσει την ευαισθησία των γενετικών αναλύσεων και έχει πολλές πρακτικές εφαρμογές.

Κατά την ανάλυση του DNA, τα θραύσματα –στόχοι είναι 

α) πυρηνικές αλληλουχίες γονιδίων που απαντώνται σε συγκεκριμένο είδος,

ή β)πολυμορφικές περιοχές, κοινές για όλα τα εμπλεκόμενα είδη, οι οποίες εκτός από πυρηνικό DNA μπορεί να προέρχονται  από μιτοχονδριακό ή πλαστιδιακό  DNA, για ζωικά ή φυτικά είδη, αντίστοιχα. Η πρώτη περίπτωση αναφέρεται στην διαφοροποίηση

οργανισμών με σχετικά μεγάλη ταξινομική απόσταση μεταξύ τους, όπως είναι η

περίπτωση της ανίχνευσης των αλλεργιογόνων τροφίμων (Brezna, Hudecova &

Kuchta, 2006), ή των γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (Meyer, 1999).

Η δεύτερη περίπτωση περιλαμβάνει κυρίως την διαφοροποίηση πολύ συγγενικών. ειδών ή ποικιλιών, χωρίς να αποκλείει και την διαφοροποίηση μη συγγενικών ειδών, και αναφέρεται κυρίως στη χρήση μοριακών δεικτών ή συντηρημένων περιοχών (conserved regions) όπως είναι κάποιες μιτοχονδριακές ή χλωροπλαστικές περιοχές . Το μιτοχονδριακό DNA έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στο παρελθόν για φυλογενετικές αναλύσεις, καθώς και για μελέτες πληθυσμών και δικαστικής. Ιδιαίτερα για την περίπτωση της φυλογένεσης η χρήση/σύγκριση του μιτοχονδριακού DNA θεωρείται πολύ πιο αποτελεσματική από ότι η χρήση ενός πυρηνικού γονιδίου . Επιπλέον, τα αντίγραφα ενός μιτοχονδριακού θραύσματος είναι πολύ περισσότερα από αυτά ενός πυρηνικού στόχου, ανά κύτταρο. Αυτό σημαίνει ότι το σήμα της PCR θα είναι πολύ πιο έντονο, καθιστώντας την ανίχνευση ενός είδους πολύ πιο εύκολη. Ο μεγάλος αριθμός των μιτοχονδριακών αντιγράφων αν και αποτελεί πλεονέκτημα για ποιοτική ανάλυση, εντούτοις, δεν ενδείκνυται για ποσοτικό προσδιορισμό διότι δεν είναι γνωστός αφού κυμαίνεται από ένα έως μερικές χιλιάδες αντίγραφα ανά κύτταρο, ενώ εξαρτάται και από το είδος του ιστού. Αυτό δεν ισχύει για τα πυρηνικά γονίδια όπου ο αριθμός των αντιγράφων τους ανά κύτταρο είναι πάντα ο ίδιος, και κατά συνέπεια ενδείκνυνται για ποσοτική ανάλυση.

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ

ΖΩΟΛΟΓΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΤΟΥ ΚΡΕΑΤΟΣ

Κατά το παρελθόν, έχουν δημοσιευθεί αρκετά αναλυτικά πρωτόκολλα

αυθεντικότητας προϊόντων κρέατος, νωπών και θερμικά επεξεργασμένων Σε όλες τις παραπάνω ενδεικτικές περιπτώσεις ο DNA–στόχος ήταν τα μιτοχονδριακά γονίδια cyt b ή 12S rDNA, ενώ σε μία περίπτωση χρησιμοποιήθηκε και χρωμοσωμικό γονίδιο αυξητικής ορμόνης. Η ακολουθούμενη μέθοδος ήταν η PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), τα προϊόντα της οποίας ανιχνεύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης ή σε σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης.

Πιο πρόσφατες δημοσιεύσεις πάνω στην αυθεντικότητα των προϊόντων κρέατος

περιλαμβάνουν πλέον και την ανίχνευση μιτοχονδριακού DNA αλόγου.

Συγκεκριμένα, οι Martin et al. (2009) ανέπτυξαν επιτυχώς PCR εκκινητές

αποκλειστικά για DNA αλόγου, στοχεύοντας το μιτοχονδριακό γονίδιο 12S rRNA

και επιτυγχάνοντας όριο ανίχνευσης (LOD) 1g/kg. Οι Kesmen et al. (2009)

ανέπτυξαν ειδικούς εκκινητές και μόρια ανιχνευτές TaqMan για την ανίχνευση

DNA αλόγου, γαϊδουριού και χοιρινού μέσω  Real-Time PCR, στοχεύοντας στα

μιτοχονδριακά γονίδια  ATP6-8, ND2 και ND5, αντίστοιχα. Σε αντίθεση με τις προηγούμενες δημοσιεύσεις, οι Koppel Ruf& Rentsch(2011) ανέπτυξαν ποσοτική μέθοδο τετραπλής Real-Time PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση βόειου, χοιρινού, πρόβειου και αλογίσιου κρέατος σε προϊόντα κρέατος, στοχεύοντας αυτή τη φορά σε χρωμοσωμικά γονίδια. Αυτά ήταν η β-ακτίνη για το βόειο και το χοιρινό κρέας, ο υποδοχέας της προλακτίνης για το πρόβειο κρέας και ο υποδοχέας αυξητικής ορμόνης για το αλογίσιο κρέας.

Συμπερασματικά, Από την υπάρχουσα βιβλιογραφία προκύπτει ένας σεβαστός αριθμός PCR εκκινητών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση του είδους του κρέατος σε νωπά και επεξεργασμένα προϊόντα, αναδεικνύοντας την  PCR σαν την  «χρυσή» μέθοδο επιλογής. Αυτό ενισχύεται και από το γεγονός ότι τα προϊόντα της PCR μπορούν να αναλυθούν και να ανιχνευτούν με αρκετούς συνδυασμούς αναλυτικών συστημάτων που απευθύνονται τόσο σε υπερεξοπλισμένα αναλυτικά εργαστήρια μοριακής βιολογίας όσο και σε σχετικά μικρά εργαστήρια χαμηλού κόστους.

Έτσι, ένα εργαστήριο μοριακής βιολογίας, μπορεί να επιλέξει μια τέτοια

αναλυτική προσέγγιση που να είναι ανάλογη του εξοπλισμού και του ανθρώπινου

δυναμικού που διαθέτει. Για παράδειγμα, το προϊόν μιας

PCR-RFLP προσέγγισης είτε μπορεί να διαχωριστεί με μια  ηλεκτροφόριση σε πηκτή αγαρόζης και να  αναλυθεί με τον πιο απλό σκοτεινό  UV θάλαμο, είτε να διαχωριστεί και να

αναλυθεί σε σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρισης.

Η ανάλυση σε ένα τέτοιο σύστημα μπορεί να προχωρήσει και με άλλες τεχνικές

που ενισχύουν την αρχική προσέγγιση, όπως είναι οι τεχνικές ανάλυσης πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs–Single Nucleotide Polymorphisms) σε συνδυασμό και με

την ανάλυση του μήκους του προϊόντος της PCR

πριν την πέψη της με περιοριστικά ένζυμα (Spaniolas et al., 2010).

Ιδιαίτερα οι τεχνικές ανάλυσης των  πολυμορφισμών SNPs δίνουν έναν ιδιαίτερα μεγάλο αριθμό επιλογών  στο  αναλυτικό εργαστήριο (Syvanen, 2001).

Πέρα των ήδη δημοσιευμένων αναλυτικών πρωτοκόλλων και δεδομένου του

Πλήθους των διαθέσιμων εργαλείων βιοπληροφορικής

και βιολογικών δεδομένων (γονιδιακές αλληλουχίες οργανισμών κλπ) διάφορων ηλεκτρονικών βάσεων δεδομένων όπως αυτή του NCBI (National Center for Biotechnology Information),

θεωρούμε ότι ο in silico σχεδιασμός μιας  DNA αναλυτικής προσέγγισης για την  διάκριση

οργανισμών σε επίπεδο είδους είναι σχετικά εύκολος και τα προσδοκώμενα αποτελέσματα, στις περισσότερες των περιπτώσεων,  επαληθεύονται  επιτυχώς στο εργαστήριο.

.

ΔΙΕΘΝΗΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

BELLAGAMBA, F., V. M. MORETTI, S. COMINCINI AND F. VALFRE (2001). "Identification

of species in animal feedstuffs by polymerase chain reaction-restriction fragment length

polymorphism analysis of mitochondrial DNA." Journal of Agricultural and Food Chemistry

49 (8):3775-3781.

BOORE, J. L., J. R. MACEY AND M. MEDINA (2005). Sequencing a

nd comparing whole mitochondrial genomes of animals. In: Molecular Evolution: Producing The Biochemical Data, Part B. (Eds. E. A. Zimmer and E. Roalson), Methods in Enzymology volume 395,

Elsevier, Massachusetts, pp. 311-348.

BREZNA, B., L. HUDECOVA AND T

. KUCHTA (2006). "A novel real-time polymerase chain

reaction (PCR) method for the detection of walnuts in food."

European Food Research and

Technology223(3):373-377.

CSAIKL, U. M., H. BASTIAN, R. BRETTSCHNEIDER, S. GAUCH, A. MEIR, M. SCHAUERTE, F.

SCHOL

Z, C. SPERISEN, B. VORNAM AND B. ZIEGENHAGEN (1998).

"Comparative analysis

of different DNA extraction protocols: A fast, universal maxi-preparation of high quality

plant DNA for genetic evaluation and phylogenetic studies." Plant Molecular Biology Reporter 16(1):69-86.

FAJARDO, V., I. GONZALEZ, I. LOPEZ

-

CALLEJA, I. MARTIN, P. E. HERNANDEZ, T. GARCIA

AND R. MARTIN (2006). "PCR

ΒΙΒΛΙΟ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ